利用紫外光，可(kě)見光，紅外(wài)光和激光(guāng)等測(cè)定(dìng)物質的(dí)吸收(shōu)光譜(pǔ)，利用(yòng)此吸(xī)收(shōu)光譜(pǔ)對物質(zhì)進行(háng)定(dìng)性(xìng)定(dìng)量分析和(hé)物(wù)質結構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法(fǎ)或分(fēn)光光(guāng)度(dù)技術(shù)，使用的(dí)儀(yí)稱為分光光度計(jì)，分光光(guāng)度(dù)計(jì)靈敏度高，測(cè)定速(sù)度快，應用範圍(wéi)廣(guǎng)，尤其是紫(zǐ)外/可見(jiàn)分光光度(dù)技術更(gēng)是生(shēng)物化(huà)學研究工作中(zhōng)*的基本(běn)手段(duàn)之一。
1.紫(zǐ)外(wài)和(hé)可(kě)見光光譜(pǔ)
光譜
光是電磁波，可用(yòng)波(bō)長(cháng)”λ”表(biǎo)示，電磁(cí)波譜是(shì)由(yóu)不(bù)同性(xìng)質的連續波長的光譜(pǔ)所組(zǔ)成(chéng)，對於生物化學來(lái)說，zui重要(yào)的波(bō)長區域是(shì)可(kě)見(jiàn)光和紫外光(guāng)。
光的波長(cháng)是(shì)二(èr)個(gè)相(xiāng)鄰的波峰之(zhī)間的間隔。光(guāng)的(dí)傳播是由相互垂(chuí)直(zhí)的電場(cháng)分量”E”和(hé)磁場(cháng)分量(liáng)”H”所構(gòu)成。
λ ＝ C/V
其中， λ-波(bō)長(cháng)； C-光(guāng)速(sù)； V-頻(pín)率(shuài)，單位時間(jiān)通過一個定點(diǎn)的波(bō)數(shù)。
光又可以看作是由具(jù)有能量(liáng)的粒子(zǐ)所組(zǔ)成(chéng)，這(zhè)些(xiē)粒子所具有(yǒu)的原能(néng)量”E”由(yóu)下式算出：
E ＝ H·V
H-普(pǔ)朗(lǎng)克常數(shù)（ 6.624×10-27爾格·秒(miǎo)）； V-頻率(shuài)。
紫外區可分(fēn)為紫外（近(jìn)紫(zǐ)外）和(hé)真(zhēn)空紫外（遠紫外(wài)）。由(yóu)於吸收(shōu)池(chí)（又(yòu)稱樣(yàng)品(pǐn)池(chí)，比(bǐ)色杯等）和光(guāng)學(xué)元(yuán)件(jiàn)以(yǐ)及(jí)氧氣(qì)能吸(xī)收小(xiǎo)於190nm 波長的光，因此(cǐ)常規紫(zǐ)外(wài)測定(dìng)集中在近(jìn)紫外區，即 200nm～400nm。可見光(guāng)區為(wéi)400nm～800nm。
組成物質的(dí)分(fēn)子均(jūn)處於(yú)一定能態並不停地(dì)運動(dòng)著，分(fēn)子(zǐ)的運(yùn)動可分為(wéi)平動，轉動，振動和(hé)分(fēn)子(zǐ)內(nèi)電子的運動(dòng)，每種(zhǒng)運(yùn)動(dòng)狀(zhuàng)態(tài)都處於一定(dìng)的能(néng)級，因此分子(zǐ)的(dí)能量(liáng)可以(yǐ)寫成：
E＝E0 E 平 E 轉 E 振(zhèn) E 電(diàn)
E0-分(fēn)子(zǐ)內(nèi)在(zài)的(dí)不隨分子(zǐ)運動而(ér)改(gǎi)變的能量(liáng)； E 平--平(píng)動(dòng)能(néng)，隻是(shì)溫度的(dí)函(hán)數因此(cǐ)與(yǔ)光譜有(yǒu)關的(dí)能量變化(huà)是(shì)分(fēn)子的(dí)轉動(dòng)能量(liáng)，振(zhèn)動(dòng)能量(liáng)和(hé)分(fēn)子的電(diàn)子(zǐ)能(néng)量(liáng)。分子的(dí)每一(yī)種(zhǒng)能(néng)量都有一(yī)係(xì)列(liè)的能級，能級不是(shì)任(rèn)意的，而(ér)是(shì)具有量(liáng)子化(huà)特征(zhēng)的(dí)，通常(cháng)分(fēn)子處於基(jī)態(tài)，當它(tā)吸收一定能量躍遷到激(jī)發態(tài)，則產生吸(xī)收(shōu)光(guāng)譜(pǔ)。分(fēn)子轉(zhuǎn)動，振(zhèn)動和(hé)電子(zǐ)能級的躍遷，相(xiāng)應(yīng)地(dì)產生轉(zhuǎn)動，振動及電子光(guāng)譜。
按(àn)照量(liáng)子(zǐ)力學原(yuán)理，分子能(néng)態(tài)按一(yī)定(dìng)的規律(lǜ)跳躍式(shì)地(dì)變化(huà)，物(wù)質在進射(shè)光的(dí)照射(shè)下(xià)，分子吸(xī)收光(guāng)時(shí)，其能(néng)量的(dí)增加(jiā)是(shì)不(bù)連(lián)續的，物質隻(zhī)能(néng)吸(xī)收(shōu)一定能量的(dí)光(guāng)，吸收(shōu)光(guāng)的頻(pín)率(shuài)和(hé)兩個能級(jí)間(jiān)的能(néng)量差要符(fú)合下列關係(xì)：
E＝E2- E1＝h
E1，E2分別表示初能態(tài)和(hé)終能(néng)態(tài)的能量，初能態(tài)與終(zhōng)能態(tài)之間的(dí)能量差愈(yù)大(dà)，則(zé)所(suǒ)吸收的(dí)光的(dí)頻(pín)率(shuài)愈高（即(jí)波(bō)長愈短(duǎn)），反之(zhī)則所吸收的(dí)光的頻率愈(yù)低(dī)（即波長愈長）。由(yóu)於(yú)吸(xī)收是不連(lián)續(xù)的(dí)，因此在(zài)光的一(yī)定部(bù)位出(chū)現一係列吸收(shōu)譜(pǔ)帶(dài)。由(yóu)於(yú)分子(zǐ)轉動(dòng)，振動及電子能級躍遷的能量差別(bié)較(jiào)大(dà)，因(yīn)此，它們(mén)的(dí)吸(xī)收(shōu)光(guāng)譜出現(xiàn)在(zài)不同(tóng)的光譜區域(yù)。分(fēn)子轉動(dòng)能級級差小，△E＜0.05電(diàn)子伏特（ev），分(fēn)子轉動(dòng)光(guāng)譜的吸收(shōu)出現在(zài)遠(yuǎn)紅外(wài)或(huò)微(wēi)波區(qū)。振動(dòng)能級間的(dí)差別(bié)較大， E＝0.05~1.0ev，振動光(guāng)譜出現在中(zhōng)紅(hóng)外(wài)區(qū)。
電(diàn)子能級(jí)的級(jí)差更大， E＝1~20ev，所以(yǐ)由電子(zǐ)躍(yuè)遷(qiān)得到的光譜(pǔ)出現在可見，紫(zǐ)外(wài)或(huò)波長(cháng)更短的光譜區。
可見(jiàn)光，紫外(wài)光(guāng)吸收光譜(pǔ)，是由於分子中較疏鬆的價電子被激發(fā)產生(shēng)躍遷從而吸(xī)收光(guāng)輻(fú)射能(néng)量(liáng)形成的，即分(fēn)子(zǐ)由基態變為(wéi)激發(fā)態(tài)，電子由一個低(dī)能(néng)級的(dí)軌道（即成(chéng)鍵(jiàn)軌道(dào)），吸收(shōu)了光(guāng)能(néng)量躍遷到高能級(jí)軌(guǐ)道(dào)（稱(chēng)為(wéi)反(fǎn)鍵軌道）。
與吸收光(guāng)譜(pǔ)有關的三種(zhǒng)是(shì)：
①二個原(yuán)子(zǐ)的電子沿(yán)其(qí)對(duì)稱方(fāng)向相互形成的共價鍵（即單(dān)鍵(jiàn)），稱(chēng)σ 鍵(jiàn)， 構成σ 鍵(jiàn)的電子稱(chēng)σ 電子(zǐ)，如C－C，C－H 鍵。
②平行於(yú)二個原子(zǐ)軌道形成(chéng)的價鍵（即(jí)雙(shuāng)鍵），稱π 鍵(jiàn)，形成(chéng)π 鍵的電子稱(chēng)為π 電子，如C=C 鍵(jiàn)。
③未共(gòng)享(xiǎng)成(chéng)鍵(jiàn)的(dí)電子(zǐ)，稱n 電(diàn)子。
各種(zhǒng)電(diàn)子躍遷(qiān)所(suǒ)需(xū)能量大小的(dí)順序是：
紫外吸(xī)收光(guāng)譜主要(yào)是(shì)由於(yú)雙鍵電子(zǐ)，尤其(qí)是(shì)共軛(è)雙(shuāng)鍵(jiàn)中的(dí)π 電子(zǐ)和未共享的電(diàn)子(zǐ)對(duì)的(dí)激發所產(chǎn)生(shēng)的。所以(yǐ)各種物質分(fēn)子(zǐ)對紫(zǐ)外(wài)光的吸光性質(zhì)取決(jué)於該分子(zǐ)的雙(shuāng)鍵數目(mù)和(hé)未共享電子對的共(gòng)軛情(qíng)況等(děng)。
表2－7 電子(zǐ)躍(yuè)遷類(lèi)型與(yǔ)紫外(wài)吸收波長(cháng)（nm）關(guān)係
